« Назад
ЛОКАЛЬНЫЕ И СИСТЕМНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИМПЛАНТАТОВ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ПРИ КОРРЕКЦИИ ВОЗРАСТНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ КОЖИ 18.05.2018 10:53
Гиалуроновая кислота (ГК) является самой крупной молекулой семейства гликозаминогликанов (ГАГ), одного из главных структурнофункциональных компонентов основного вещества в различных тканях организма. В составе протеогликанов ГК во многом определяет механические свойства соединительной ткани (прочность, упругость, объем), в том числе как стромы паренхиматозных органов . Ионообменная активность ГК, способность связывать воду, катионы и низкомолекулярные вещества влияют на трофику и регенерацию клеток (через гликокаликс) и тканей.
При дисплазиях соединительной ткани и старении организма количество и качественный состав протеогликанов меняется вследствие нарушения динамического равновесия процессов их ферментативного расщепления и синтеза клетками соединительной ткани и ее производных. Это неизбежно отражается на трофике, репарации и механических свойствах различных тканей. Содержание ГК в коже значительно снижается по мере старения организма. Это предопределило пути борьбы с ее возрастными изменениями посредством введения препаратов ГК как одного из современных инструментов эстетической медицины. За счет способности линейных молекул ГК формировать золь-гель с регулируемой вязкостью посредством контролируемого диаметра частиц геля вещество в течение определенного времени биодеградации поддерживает свою желеобразную форму. Это позволило разработать и довести до клинической практики гели ГК как удобные в использовании инъекционные имплантаты для коррекции возрастных изменений кожи (например, NCTF 135HA компании Filorga или Repleri фирмы NovoNexus) и других тканей (в частности, для суставов «Ферматрон» фирмы Biomet). Предполагается, что молекулы ГК могут влиять на хемотаксис фибробластов в зону введения имплантата. Вопрос о влиянии имплантатов ГК на стромальные стволовые клетки остается для регенеративной медицины открытым. В то же время ГК представляет собой гигантскую полимерную молекулу (длина около 1,7 мкм) с чередующимися дисахаридными единицами, состоящими из глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина. Данные мономеры, неизбежно выделяющиеся в процессе ферментативной биодеградации ГК, обладают собственными как локальными, так и системными биологическими эффектами. Однако возможность дистантного влияния имплантатов ГК на гомеостаз изучалась, по-видимому, только в плане доклинических токсикологических испытаний вещества. Цель исследования – изучить ответ культуры стромальных клеток человека на имплантат ГК in vitro и оценить потенциальные системные реакции организма пациентов на ГК при коррекции возрастных изменений кожи.
Материал и методы
В экспериментах in vitro использована культура пренатальных клеток человека, выделенных из легкого (ПКЛЧ) (линия FL-42, ООО «Банк стволовых клеток», г. Томск). После размораживания препараты представляют собой популяцию клеток округлой формы и размеров с ограниченным сроком жизни, сохраняющую при пассажах стабильный кариотип и онкогенно безопасную. Клетки прилипают к пластику и к 8-м сут культивирования принимают фибробластоподобную морфологию. Иммунофенотип клеточной культуры представлен CD34–-, CD44+-антигенами, что позволяет отнести их к негемопоэтическим клеткам, несущим рецептор (CD44) к гиалуроновой кислоте (ГК). В присутствии остеогенных добавок часть клеток дифференцируется в остеобласты. Представленная характеристика позволяет отнести линию FL-42 к пулу мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Для культивирования клеток пользовались протоколом следующего состава: 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 10–6 моль дексаметазона, 280 мг/л Lглутамина, 50 мг/л гентамицина сульфата, 20% сыворотки крови эмбрионов коров, 80% среды ДМЕМ/F12 (1:1). Клеточную взвесь добавляли в концентрации 2 104 жизнеспособных кариоцитов в 1 мл полной культуральной среды в лунки 24-луночных планшетов (Orange Scientific, Бельгия) и культивировали при 36С для прилипания клеток к пластиковой поверхности. Через 1 ч в лунки добавляли по 250 мкл геля Repleri (ООО «НовоНексус», Россия), чтобы заполнить всю площадь лунки планшета (площадь 1,77 см2). Контролем роста служила культура клеток на пластике с добавлением эквивалентного объема культуральной среды. В каждой группе использовали по четыре лунки, что позволило использовать по одному шприцу (объем 1 мл) гелей № 1, 2, 3 или 5. Лекарственное средство представляет собой микроинъекционный гель ГК неживотного происхождения разной вязкости, предназначенный для имплантации в кожу лица для эстетической коррекции объемных дефектов кожного покрова посредством его заполнения (филерный эффект). Препарат (концентрация 24 мг/мл), содержащийся в филерах Repleri, представляет собой гелевые частицы стабилизированной ГК, суспендированные в менее стабилизированной ГК в растворе хлорида натрия до 1 мл. Других наполнителей не содержит. Линейный размер частиц ГК варьирует от 0,1– 0,15 мм (гель № 1) до 1,25–2 мм (гель № 5). Различная плотность инъекционной формы имплантата была необходима для контурной пластики носогубных, периорбитальных, носощечных и носослезных морщин в зависимости от глубины кожных дефектов. Через 5 сут культивирования при температуре 36С и 100% влажности гель Repleri удаляли из лунок, сушили культуры клеток на воздухе в течение 24 ч. Затем выполняли фиксацию прилипших клеток в течение 30 с в парах 100%-го формалина. Из удаленного геля готовили тонкие мазки на стекле, сушили на воздухе, фиксировали в метаноле. В дальнейшем осуществляли цитохимическую окраску клеток на пластике и стекле на щелочную (ЩФ) и кислую (КФ) фосфатазы. Активность ЩФ определяли в клетках методом азосочетания по G. Gomori в модификации А.Г. Михеева, КФ – методом азосочетания по A. Goldberg и T. Barka (1962). Применяли реактивы нафтол-ASBI фосфат, соль прочного синего РР фирмы Lachema (Чехия). Кроме того, для исследования морфологии клеток часть препаратов окрашивали азуром II и эозином в течение 5 мин, изучали и фотографировали препараты с разрешением 8 мегапикселей на дюйм с использованием возможностей оптического микроскопа и системы видеодокументации Carl Zeiss.
В пилотном клиническом исследовании с марта 2011 г. по март 2012 г. принимали участие восемь женщин в возрасте 34–55 лет (средний возраст (42 ± 2) года). Каждой пациентке в проблемные зоны лица вводили имплантаты внутридермальные Repleri (регистрационное удостоверение Росздравнадзора № ФСЗ 2008/03147 от 02.12.2008) в суммарной дозе ГК 48 мг). При этом пяти пациенткам проводилась коррекция средних и глубоких морщин носогубных складок и носощечных морщин (гели № 3, 4). У трех женщин выполнялась коррекция носогубных складок, периорбитальных морщин и носослезной борозды гелями № 1, 2. Все пациентки подписали информированное согласие на участие в исследовании. Критерии исключения пациенток из исследования: гиперчувствительность к ГК, беременность и кормление грудью, острые воспалительные или инфекционные поражения зоны интереса, отсутствие информированного согласия пациента и его отказ от процедуры. Препарат ГК нельзя сочетать с лазерными процедурами, пилингом и другими дермальными наполнителями. До имплантации и через 10–12 мес после нее у пациенток проводили ультразвуковое исследование кожи. С помощью комплекса Aramo TS тестировали влажность, эластичность и жирность кожи. Потенциальное системное влияние дермальных имплантатов Repleri оценивали по изменению показателей крови у каждой пациентки до имплантации и через 10–12 мес после нее. Периферическую кровь выделяли из локтевой вены, собирали в пробирки типа Vacuette (BD Diagnostics, США). В ООО «Открытая лаборатория» по общепринятой биохимической технике согласно инструкциям фирмпроизводителей определяли концентрации глюкозы (ммоль/л), общего белка (г/л), мочевины (ммоль/л), креатинина (мкмоль/л), общего кальция (ммоль/л), холестерина (ммоль/л), липопротеидов низкой (ЛПНП, ммоль/л) и высокой плотности (ЛПВП, ммоль), триглицеридов (ТГ, ммоль/л), активности аспартатаминотрансферазы (АСТ) и щелочной фосфатазы (Ед/л) на биохимическом анализаторе, исследовали уровни кортизола (нмоль/л) и соматотропного гормона (СТГ, нг/мл) с помощью иммуноферментного анализа. При оценке полученных данных были использованы методы статистического описания, а также методы проверки статистических гипотез, использующиеся в стандартных пакетах программ Statistica 6.0. Полученные результаты выражали как медиану Ме, 25%й (Q1) и 75%-й (Q3) квартили. Для оценки статистической значимости различий использовали непараметрический Т-критерий Вилкоксона для зависимых выборок. С целью выявления связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ по Спирмену. Различия считались статистически значимыми при уровне значимости р < 0,05.
Результаты и обсуждение
В настоящее время активно изучаются in vitro двумерные (2D) и трехмерные (3D) конструкции, имитирующие естественное микроокружение для стволовых клеток на основе полимерных и гелевых матриц. В связи с этим было выполнено сокультивирование линии FL-42 культуры ПКЛЧ с гелевыми имплантатами Repleri различной плотности. Подобные работы необходимы для понимания механизмов влияния имплантатов на процессы клеточной регенерации при их введении пациентам. Исследование in vitro реакции стромальных стволовых клеток человека показало, что в контрольной группе роста наблюдалось достаточно равномерное распределение клеток по поверхности лунок культурального планшета. Клетки различного диаметра (10–30 мкм) имели преимущественно округлую форму, единичные мононуклеары окрашивались на щелочную фосфатазу (ЩФ). В целом описанные морфофункциональные свойства характерны для данной линии клеток человека при краткосрочном культивировании в среде без остеогенных добавок. После контакта клеточной популяции с гелем Repleri различной плотности в сравнении с контролем в поле зрения отмечались только единичные клетки, прилипшие к пластиковой поверхности культуральных планшетов. Мазки геля, извлеченного из лунок планшета, позволили обнаружить неправильной формы клетки с псевдоподиями, расположенные между частицами ГК
Полученные данные позволили заключить, что стромальные клетки, несущие рецептор к гиалуроновой кислоте, мигрируют в структуру геля и претерпевают морфологическое созревание в фибробластоподобные формы. Примерно двукратное уменьшение площади
клеток, расположенных в геле, по сравнению с культурой на пластике говорит о принятии ими трехмерной (3D) ориентации. Таким образом, хемотаксический эффект ГК реализуется не только на уровне зрелых фибробластов кожи, как полагают, но и их клеток-предшественников. Цитохимическое исследование показало, что стромальные клетки, эмигрировавшие с пластиковой поверхности лунок планшетов в гель, практически не окрашивались на ЩФ, но воспринимали краситель для кислой фосфатазы. Кислая фосфатаза – лизосомальный фермент многих стромальных (фибробласты, остеобласты) и кроветворных клеток (моноцитымакрофаги, гранулоциты, лимфоциты). Позитивно окрашивающиеся на КФ клетки обнаруживаются в составе колониеобразующих и кластеробразующих единиц фибробластов, которые представляют собой гетерогенную популяцию родоначальных мезенхимальных клеток в разной стадии дифференцировки. Фибробласты, экспрессирующие КФ, назвали фиброкластами, способными ремоделировать межклеточный матрикс соединительной ткани и ее производных. В связи с этим инъекция имплантатов Repleri в качестве наполнителей (филеров) для эстетической коррекции глубоких морщин должна сопровождаться ферментативной деградацией и клеточной резорбцией искусственного материала, что отмечается в инструкции к препарату. В таком случае неизбежно высвобождение мономерных единиц ГАГ (глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина). Они легко проникают в кровь и могут оказывать системный эффект на организм пациенток. Как следствие, в группах пациенток до и после имплантации геля было проведено изучение биохимических показателей крови (таблица) как интегральной системы, отражающей общее состояние всего организма.
Заключение
Стромальные стволовые клетки человека, несущие рецептор CD44 к гиалуроновой кислоте, мигрируют in vitro в структуру геля и претерпевают морфологическое созревание в фибробластоподобные формы, позитивно окрашивающиеся на кислую фосфатазу. Имплантация гелей Repleri в группе пациенток с локальными и системными возрастными изменениями гомеостаза дает положительный местный эстетический эффект, связанный с полным сглаживанием носогубной складки кожи лица. Введение в кожу гелей Repleri реально (в течение 1 года) улучшает системные показатели биологического возраста в сравнении с хронологическим (паспортным). В крови пациенток статистически значимо снижаются уровни липопротеидов и аспартатаминотрансферазы. Обнаруженный эффект можно рассматривать в качестве средства антивозрастной терапии не только кожи, но и паренхиматозных органов. В то же время в связи с гормональными реакциями организма при местном назначении гелей Repleri требуются меры длительного контроля показателей гомеостаза у контингента пациенток с серьезными изменениями внутренних органов.
|
